Abstract
DNA甲基化是表观遗传中的一种，它能够调控多种生物途径，例如：基因的表达、基因组的稳定性。在植物中对某个位点突变或者使用药物的方法被用来研究DNA甲基化的作用。许多工具就能够直接的对特定位点的DNA甲基化进行操作，从而评估DNA甲基化在特定途径中的直接效应。最近研究者们，通过改造DNA-binding蛋白，实现对甲基化机器的招募，从而改变特定位点的DNA甲基化水平。
背景
DNA甲基化是一种保守的表观遗传标记，调控着包括基因表达、基因组稳定性和基因印记等多种生物学过程；因此破坏DNA甲基化会导致发育异常。在植物中，DNA甲基化包含以下几种:
- CG甲基化
- CHG
- CHH
这些甲基化标记主要富集在异染色质区域的转座子、重复序列上，并且扮演着一个主要的角色-在转录水平沉默基因的表达。在内含子区域的转座子、重复元件的甲基化同样会影响mRNA的加工，例如改变mRNA的剪切方式、改变mRNA3‘端的多聚腺苷酸位点。在有些地方，DNA甲基化也能够促进基因的表达，通过DNA methyl-readers SU3-9.
通过基因突变或者药物的方式虽然能够改变DNA甲基化，但是这些方法是全基因组范围的改变甲基化水平，不能够实现研究特定位点的甲基化。因此为了达到这个目的，研究者们通过开发一些位点特异的工具来操纵DNA甲基化水平，并且在特定位点改变基因的表达模式来产生新的等位基因。
植物中DNA甲基化机制
在植物中，通过RNA介导的DNA甲基化（RdDM）途径来调控DNA的甲基化水平。DNA甲基转移酶2（DRM2）在不依赖于序列特异性的情况，催化新的DNA的甲基化。在RdDM途径中，植物中特异的RNA聚合酶IV合成单链RNA，进而在RDR2的催化下合成双链RNA（dsRNA）。dsRNA在DCL3的催化下被切割成24nt的small interfering RNA（siRNA），最后和AGO4/6 形成复合物。
在组蛋白reader SHHH1和CLASSSY的招募下，RNA聚合酶IV被招募到染色质区域，通过AGO-siRNA的与目标序列进行互补，RNA聚合酶IV合成non-coding RNAs。一旦形成了 AGO-siRNAncRNA-Pol V ribonucleoprotein complex ，DRM2倍招募到DNA处，进行甲基化
在新的甲基化位点生成后，通过MET1、CMT2/3维持DNA的甲基化；这些酶分别针对CG|、CHH、CHG三种甲基化类型。在经历多轮的DNA复制后，DNA甲基化也可能会丢失在缺少 methylation maintenance时。植物中的去甲基酶就包括ROS1、DME、DML2/3。
在植物中靶向操纵DNA甲基化
通过siRNAs介导靶向甲基化
研究者通过使用不同的病毒、或者转化载体来产生与靶标位点互补的siRNAs。当siRNA靶向基因的启动子区域时，能够诱导RdDM和基因的转录沉默，其中应用最广泛就是VIGS。反向重复序列IR，同样能够产生siRNAs。
改造DNA-binding蛋白操纵DNA甲基化
例如DNA结合蛋白： ZFs、TALEs 、CRISPR-dCas9，直接结合到靶标位点来招募甲基化机器改变附近的甲基化水平。这些改造的DNA-binding蛋白即使在缺少siRNAs的情况下，依旧能够招募聚合酶IV和AGO来驱动DNA的甲基化
靶向的去除DNA的甲基化
同样是使用改造的DNA-binding蛋白对靶标位点进行去甲基化，在动物中对FWA，进行可遗传的去甲基化，促进FWA的表达。
conclusions
这些靶向的操纵特定位点的甲基化工具虽然能够起到作用，但是如何精确、高效的并且减少脱靶率仍旧是需要进一步优化的。这些工具可以被用来修复那些不希望出现的甲基化位点，例如在植物的组织培养中后代甲基化水平的改变。并且甲基化化水平的改变是能够永久遗传的，从而改变基因的表达模式；可以考虑作为产生新的等位基因的一种方式。这些tools直接操纵蛋白质和RNA，不需要经过遗传转化从而实现操纵植物DNA的甲基化。
参考
- DNA methylation in plants: mechanisms and tools for targeted manipulation
